روش Real-Time PCR
واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی (Real-Time PCR)، که به عنوان PCR کمی (qPCR) نیز شناخته میشود، یک تکنیک پیشرفته در زیستشناسی مولکولی است که امکان مشاهده و اندازهگیری لحظهبهلحظه تکثیر DNA را فراهم میکند. این روش با استفاده از مواد فلورسانت، میزان محصولات تولیدشده در هر چرخه را شناسایی و ثبت میکند.
دستگاه Real-Time PCR چگونه کار میکند؟
دستگاه Real-Time PCR شامل بخشهای مختلفی است که به صورت هماهنگ عمل میکنند تا فرآیند تکثیر DNA و اندازهگیری آن به صورت همزمان انجام شود:
- ترموسایکلر: بخشی که دمای چرخههای PCR (Denaturation، Annealing، و Extension) را تنظیم میکند.
- سیستم نوری (Optical System): برای تشخیص سیگنالهای فلورسانت تولیدشده در هر چرخه استفاده میشود. این سیستم شامل لامپهای LED یا لیزر و آشکارسازهای حساس (مانند CCD یا فتودیود) است.
- نرمافزار تحلیل دادهها: سیگنالهای ثبتشده را پردازش کرده و منحنیهای تقویت (Amplification Curves) و دادههای کمی را تولید میکند.
بیان ژن با تکنیک Real-Time PCR و مراحل تکنیک Real-Time PCR :
تکنیک Real-Time PCR شامل مراحل متعددی است که بهطور خلاصه در زیر توضیح داده شدهاند:
- تهیه RNA و تبدیل آن به DNA
در مرحله نخست، RNA از نمونه استخراج و به کمک آنزیمهایی مانند MMLV به DNA مکمل (cDNA) تبدیل میشود. این مرحله برای آمادهسازی مواد ژنتیکی جهت تحلیل ضروری است. - شروع فرآیند سیکلهای Real-Time
پس از تثبیت نمونههای ژنتیکی، فرآیند ورود به سیکلهای Real-Time PCR آغاز میشود. این سیکلها شامل واکنشهایی است که امکان بررسی و تحلیل لحظهای تغییرات را فراهم میسازد. - اندازهگیری کمیت DNA
در این مرحله، میزان DNA تولید شده توسط دستگاه به کمک سیستم نوری پیشرفته اندازهگیری میشود. این کار اساساً بهصورت کمی و دقیق انجام میگیرد. - انجام سیکلهای پلیمریزاسیون
با ورود نمونه به سیکلهای پلیمریزاسیون، ماده فلورسنتی نظیر سایبرگرین (SYBR Green) به واکنش اضافه میشود که به DNA تکثیر یافته متصل خواهد شد. - ثبت سیگنال فلورسنت
در حین تکثیر DNA، رنگ سایبرگرین به رشتههای تازه تشکیلشده میچسبد. دستگاه Real-Time PCR با استفاده از فناوری تشخیص فلورسانس، این سیگنالها را ثبت و تحلیل میکند. - تکثیر و تولید DNA جدید
در پایان، DNAهای جدید تولید شده که رنگ سایبرگرین به آنها متصل است، برای انجام تحلیلهای بیشتر آماده میشوند. این فرایند امکان اندازهگیری دقیق بیان ژن را فراهم میکند.
روش Real-Time PCR به دلیل دقت بالا و توانایی بررسی لحظهای، یکی از روشهای استاندارد در مطالعات بیان ژن است.
روشهای انجام Real-Time PCR:
- مشاهده لحظه به لحظه تکثیر: این امکان را فراهم میکند تا فرآیند تکثیر در هر چرخه بررسی شود.
- قابلیت اندازهگیری دقیق: با استفاده از روشهای کمی مطلق و نسبی، میتوان میزان دقیق الگوی اولیه را تعیین کرد.
- سرعت بالا: به دلیل سرعت بالای واکنشها، زمان کمتری برای انجام آزمایش نیاز است.
- کاهش آلودگی: با حذف مراحل پس از PCR مانند الکتروفورز، احتمال آلودگی کاهش مییابد.
کاربردهای Real-Time PCR:
- تشخیص بیماریهای ویروسی: مانند تشخیص ویروس HPV و HIV.
- بررسی بیان ژن: برای سنجش میزان بیان ژنها در شرایط مختلف.
- تشخیص جهشها: برای شناسایی جهشهای ژنتیکی در نمونهها.
مراحل انجام Real-Time PCR:
- استخراج RNA: ابتدا RNA از نمونه استخراج میشود.
- سنتز cDNA: با استفاده از آنزیم نسخهبردار معکوس، RNA به cDNA تبدیل میشود.
- انجام PCR: cDNA به عنوان الگو در واکنش PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و مواد فلورسانت مورد استفاده قرار میگیرد.
- تحلیل دادهها: سیگنالهای فلورسانت در هر چرخه ثبت و تحلیل میشوند تا میزان اولیه الگو تعیین شود.
جمعبندی:
Real-Time PCR به دلیل دقت و حساسیت بالا، به عنوان یک ابزار قدرتمند در تحقیقات ژنتیکی و تشخیصهای پزشکی مورد استفاده قرار میگیرد. این تکنیک امکان تحلیل سریع، دقیق و حساس نمونهها را فراهم کرده و به ویژه در حوزههای ویروسشناسی، بیان ژن و ژنتیک کاربرد گستردهای دارد
